细胞冷冻过程有四个要点：细胞的收获、保护剂的使用、冷冻速率和储存环境。
一、细胞的收获
用来冻存的细胞一般选择在细胞约铺满90%的时候，这时细胞生长状态好，细胞数量也多，并且在收获细胞前24小时换一次培养液。收获用来冻存的细胞开始时方法和平时一样，用100xg离心5分钟收集细胞再重悬，活细胞记数。
稀释或浓缩到细胞保存的细胞浓度的二倍（一般是400-1000万细胞/ml），加入已经配好的等体积的培养液保护剂混合溶液中轻轻混匀，分装到冻存管，冷冻保存。
二、保护剂的使用
细胞冻存中，一般使用DMSO作为保护剂。在动物细胞株冻存中，DMSO使用的浓度一般是5-15%，某种具体细胞的冻存液中的DMSO浓度可以从ATCC查到。
对特别敏感的细胞特别是杂交瘤细胞在冻存时使用95%血清和5%DMSO可能会好些。保护剂在使用时先用培养液或血清配成浓度的2倍，再与等体积的悬浮细胞的培养液混合。
三、细胞冻存的速率
动物细胞株的冷冻速率适控制在让细胞有足够的时间脱水而又不被过度脱水导致细胞损害。对大多数细胞来说，每分钟降1至3℃是合适的。通常的操作是把细胞先在-20℃1-2个小时，再放入-80℃冰箱过夜（如果没有-80℃冰箱，可以用干冰替代），再转入液氮罐或低于-130℃的冰箱长期保存。
四、储存环境
细胞长期保存温度是-130℃或更低。液氮罐中气态层温度在-140℃至-180℃之间，动物细胞株可保存在气态层或浸入液氮中，如果可能保存在气态层，因为这样可避免由于有液氮进入冻存管而在拿出细胞时引起爆炸（但是这样液氮罐内只能存储少量液氮，需要经常添加）。细胞也可以在-80℃冰箱保存几个月左右的时间。
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